快速鼠尾基因型鉴定（PCR法）试剂盒
快速鼠尾基因型鉴定（PCR法）试剂盒
发布日期：2019-09-10 浏览次数：252
快速鼠尾基因型鉴定（PCR法）试剂盒
说明书
产品组分
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组分名称 |
M00301-100T |
M00301-500T |
M00301-1000T |
存储条件 |
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鼠尾裂解液 |
10 ml |
25ml×2 |
25ml×4 |
4°C |
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蛋白酶K |
1 ml |
1 ml×5 |
1ml×10 |
-20°C |
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2×PCR Easy Mix |
1ml |
1ml×5 |
1ml×10 |
-20°C |
实验方法
1、组织消化
1.1按照小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：
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单样本 |
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蛋白酶K |
10 μl |
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鼠尾裂解液 |
100 μl |
组织消化液现用现配，充分混匀后使用。
1.2 向每个含有样本的EP管中加入100 μl新鲜组织消化液，55°C水浴/金属浴中消化30分钟。组织消化时，请务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上依然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。
1.3 将样本置于95°C水浴/金属浴中孵育5分钟以灭活消化液中蛋白酶。12000rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清可于-20°C保存三个月。
2、PCR扩增
2.1 PCR反应体系的配制：
最好于低温环境下（如冰浴中）完成，以保证PCR扩增效率和特异性。
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PCR反应组分 |
20 μl反应体系 |
50 μl反应体系 |
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模板（消化产物） |
2 μl |
5 μl |
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正向引物（10 μM） |
0.5 μl |
1 μl |
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反向引物（10 μM） |
0.5 μl |
1 μl |
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2×PCR Easy Mix |
10 μl |
25 μl |
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ddH2O |
7 μl |
18 μl |
2.2 PCR反应条件：
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温度（°C） |
时间 |
循环数 |
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94 |
5 min |
1 |
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94 |
20 sec |
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50-65 |
30 sec |
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72 |
X min (1kb/min) |
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72 |
5 min |
1 |
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4 |
-- |
1 |
3、琼脂糖凝胶电泳
试剂中含有溴酚蓝染料，PCR产物可以直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。另外PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至T载体，用于DNA测序。
常见问题及对策分析
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常见问题 |
可能原因 |
对策 |
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样本组与阳性对照组均无扩增条带 |
PCR反应条件设置不当 |
优化PCR反应条件 |
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PCR引物质量问题 |
重新设计PCR引物 |
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样本组无扩增条带而阳性对照组正常 |
不当储存或长期储存引起试剂活性丧失 |
使用新鲜的试剂 |
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组织消化不够充分 |
延长55°C消化时间至60min |
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蛋白酶未被完全灭活 |
消化产物在95°C孵育5min |
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存在非特异性扩增条带 |
PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高 |
增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度 |
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PCR引物错配 |
重新设计PCR引物 |
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配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久 |
PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后请尽快进行PCR扩增反应 |
