RNA 提取试剂（Trizol）

产品组分
 

 
产品简介
       该产品是一种即用型，适用于细胞或组织总 RNA 提取的含有指示剂的试剂。该产品的作用原理采用与 Invitrogen 公司的 TRIzol 相似的原理和方法，主要成分为苯酚和异硫氰酸胍等，提取步骤和方法也相同。指示剂的颜色也与 TRIzol 的颜色一致，加入氯仿后离心分层，形成上清层、中间层和有机层，上层水相（含 RNA）呈无色，下层有机相呈紫红色。RNA 经异丙醇沉淀便可得到总 RNA。该产品具有极强的裂解能力，可以短时间内裂解细胞和组织样本，并有效抑制样本中 RNA 的降解，保持RNA 的完整性。提取的RNA 可直接用于多种分子生物学实验，比如RT-PCR， Northern blot，体外翻译、cDNA 克隆、RNase 保护实验以及高通量测序等对 RNA 质量要求较高的情况。

使用注意事项

1、本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会引起中毒、灼伤及其他身体伤害。使用时应穿戴防护服装、手套、面罩等防护物。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量水冲洗然后前往医院进行治疗。
2、请穿实验服并佩戴一次性手套进行实验操作，避免 RNase 污染。
3、使用 RNase-free 的塑料制品和枪头避免交叉污染；所有离心管及相关溶液都必须无 RNA 酶污染。
4、请自备氯仿、异丙醇（新开封或提取 RNA 专用）、75%乙醇（DEPC 处理水配制）、DEPC 和 DEPC 处理水。
5、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常会比新鲜的细胞或组织差一些，因为冻存过程中细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。推荐：如果不能及时抽提 RNA，先加入适量 Trizol 试剂，裂解样品然后再冻存，这样 RNase 就不会降解样品。

6、样品匀浆后，加入氯仿前，可在-80°C 冻存放置一个月。
7、RNA 沉淀可以保存在 75%乙醇中，2-8°C 放置一周或-20°C 放置一年。
8、该试剂盒仅限于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断或治疗，更不得用于食品或药品中。

实验步骤

1、细胞裂解或组织匀浆：
          a. 贴壁细胞：吸尽培液，按照比例加入 Trizol 消化细胞，即每 10 平方厘米细胞中加入 1 ml Trizol，六孔板每孔加 1 ml Trizol，12 孔板每孔加 0.5 ml Trizol。晃动 3-5 下，再用移液器反复吹打几下，确保细胞全部裂解，然后将溶液转移至离心管中。【注】加入 Trizol 量不足时，会导致 DNA 污染。
          b. 悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每5×10⁶-1×10⁷ 个细胞加入1ml Trizol， 再用移液器反复吹打。【注】加入 Trizol 前应避免洗涤细胞，会增加 mRNA 降解的可能性。
          c. 动、植物组织：取-80°C 冻存的组织在液氮中充分研磨后加入适量的Trizol混匀；或者取新鲜动物或植物组织尽量剪碎，然后加入适量的 Trizol 进行匀浆处理。
2、将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置 5 分钟以使核蛋白体完全裂解。【注】此步不能省略，时间可以长于 5 分钟。
3、（可选步骤）4°C，12000rpm 离心 10 分钟，取上清。【注】如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等可离心除去。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量的 DNA 等物质，上清中含有 RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂， 应除去，然后再取澄清的匀浆溶液进行下一步的操作。
4、每毫升 Trizol 加入 0.2ml 氯仿，Vortex 混匀或猛烈晃动 15 秒，室温放置 3分钟。
5、4°C，12000rpm 离心 15 分钟，样品会分成三层：上层无色的水相、中间蛋白层和紫红色的下层有机相。然后吸取含总 RNA 的上层无色水相至一新的RNase-free 的离心管中。

6、按照每毫升最初的 Trizol 加入 0.5 ml  异丙醇的比例，颠倒数次混匀，室温沉淀 10 分钟，或者-20°C 沉淀 30 分钟，或-70°C 沉淀过夜。【注】如果希望提取microRNA 等小 RNA 时，推荐使用低温长时间的沉淀，来获得最佳效果。
7、4°C，12000rpm 离心 10 分钟，在管底可见 RNA 沉淀，弃上清。【注】纯度越好的 RNA 沉淀会在管侧和管底形成透明胶质状，不容易看清楚。
8、按照每毫升最初的 Trizol 加入 1 ml 75%乙醇（DEPC 水配制）的比例，Vortex混匀或颠倒混匀，让沉淀悬浮起来以充分洗涤沉淀中的盐分。
9、4°C，12000rpm 离心 5 分钟，弃上清。剩余的少量液体再用离心机瞬甩一下， 彻底去掉上清液。注意不要吸到沉淀，否则会造成 RNA 损失。
10、室温放置空气干燥 5-10 分钟，待 RNA 沉淀略干后，加入适量（约 20-100µl）的 RNase-free 水溶解 RNA 沉淀，-80°C 冻存。【注】切勿让 RNA 彻底干燥，否则将导致 RNA 溶解度降低。

产物检测

1、RNA 完整性检测
        取 1 µl RNA 加入适当 RNA loading buffer，混匀，进行电泳检测。若出现清晰的三条带，分别为 28S、18S 和 5S，且条带之间界限清晰，就证明 RNA 样品的完整性非常好。可参考以下图示：

2、RNA 纯度检测

     利用分光光度计或者NanoDrop 仪检测RNA 样品在260nm、280nm 处的OD 值， 并计算 A260/A280 的比值。纯的 RNA 的比值应在 2.0 左右。

常见问题分析

1、提取到的 RNA 得率很低。

可能的原因如下：
1、样品裂解或匀浆处理不彻底。
2、RNA 沉淀条件和时间太短，没有充分沉淀 RNA 造成 RNA 损失。
3、最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。

2、RNA 降解

可能的原因如下：
1、组织取出后没有马上进行处理或冷冻，导致 RNase 的释放降解样品中的RNA。
2、贴壁细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
3、样本量太大而加入的 Trizol 液少，导致裂解不完全，不能有效抑制 RNase的活性，进而导致 RNA 降解。
4、提取过程中使用的溶液、离心管或枪头未经 RNase 去除处理。
5、RNA 沉淀没有保存于-80°C。
6、RNA 电泳时的电泳液及电泳槽中含有 RNase，或者电泳时电泳液温度过高， 造成 RNA 样品被降解。

3、蛋白和多糖污染

可能的原因如下：
1、样品中蛋白和多糖含量高，建议加入氯仿之前先高速离心去除蛋白和多糖。
2、吸取上层无色水相时不小心吸入一些中间蛋白层的物质，建议将移液枪头中的液体放回分层的离心管中，重新进行离心后再小心吸取上层水相即可。
3、样品量太大，裂解不完全也会导致 RNA 样品中蛋白和多糖污染。

4、A260/A280 的比值低于 1.65
可能的原因如下：

1、RNA 样品溶于 TE 溶液，低离子浓度和低 pH 条件下，A280 的数值会较高， 导致比值低。
2、样品匀浆时加的 Trizol 试剂量太少。
3、匀浆后样品未在室温放置 5 分钟，会导致蛋白的析出不完全，也会增加 A280的数值。
4、最后得到的 RNA 沉淀溶解不完全。

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