人间充质干细胞（HUMSCs）无血清培养基
人间充质干细胞无血清培养基
- 产品简介
人间充质干细胞无血清培养基是由苏州君欣生物团队精心优化筛选的一款化学成分明确、无异种动物源成分的完全培养基，适用于人间充质干细胞（包括脐带，脂肪，骨髓等来源）的无血清条件下原代分离及传代培养，具备保持间充质干细胞的多项分化潜能及维持其良好的增殖速率的特性。
- 产品主要成分
人间充质干细胞无血清培养基的主要组成成分：氨基酸、维生素、无机盐、白蛋白、细胞因子、胰岛素、微量元素等。
- 产品特点
1. 无异种动物源成分，批间差异小；
2. 生产过程符合GMP指导原则，严格执行低内毒素标准
3. 经过微生物检测（细菌、真菌、霉菌及支原体）、pH检测、渗透压检测以及内毒素检测
4. 无需包被培养板，可用于原代细胞分离及传代，扩增效率高
- 产品稳定性
1. 所有的产品都需要避光保存。
2. 无血清基础培养基在2-8℃保存，添加剂在-20度以下保存。
3. 超过标签注释的有效期产品，不建议使用。
4. 配制成完全培养基后，避光保存在2-8℃可存放3-4周，避免反复冻融。
- 产品规格与存储
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组分 |
规格 |
数量 |
保存条件 |
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人间充质干细胞基础培养基 |
450ml |
1瓶 |
2-8℃，避光保存 |
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人间充质干细胞添加剂 |
50ml |
1瓶 |
-20℃，避光保存 |
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- 产品使用方法
1. 人间充质干细胞无血清培养基配制
将人间充质干细胞添加剂在2-8℃完全融化，按1：49的比例加入到基础培养基中，混合均匀，即为人间充质干细胞完全培养基。
注： 添加剂应避免反复冻融，若小量、多次使用，建议分装后于-20℃冰箱避光保存。双抗非必须，但原代（P0）分离时建议使用。
2. 原代间充质干细胞分离（组织块法）
2.1 无菌条件下取新鲜脐带，用预冷的DPBS漂洗净血迹。
2.2 置10cm 培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管及上皮组织，用DPBS洗净血迹，再剪成1mm3 组织块。
2.3 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 3个孔中。
2.4 37°C，5%CO2 培养箱孵育 30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。
2.5 向每孔滴加 0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。
2.6 37°C，5% CO2 培养箱孵育过夜，次日 (D1) 每孔再补加 1ml 完全培养基。
2.7 37°C，5% CO2 继续培养，5天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但最快 3 天就可看到细胞从组织边沿爬出)。
2.8 再过 3天（D9、D12）后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但最晚可到 14 天会出现细胞从组织边沿爬出) 。
2.9 之后每 2 天换一次培养液，继续培养 2~4 天，待细胞融合度(Confluency)达到约 80% 后传代培养。
注 :组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。
3. 人间充质干细胞传代与冻存
3.1 待细胞融和度达到约 80%后进行传代(细胞不能太密集，否则容易分化)，吸弃传代板孔中的培养基，每孔加适量 DPBS 轻轻冲洗 1 次。
3.2 根据培养皿适量加入温和型细胞消化液(君欣生物, Cat#03-079-1A，T25 建议使用 1ml)， 在 37°C，5% CO2 培养箱作用 3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落)。
3.3 显微镜下观察细胞完全脱落后，用移液器轻轻吹打细胞，使细胞完全脱落，然后1000rpm 离心 3~5min。
3.4 谨慎吸出上清，细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。
3.5 按照所需的比例进行传代（1:2~1:4）或按照 8000cells/cm2 的细胞密度将细胞接种至培养器皿中，放入 37°C, 5% CO2 培养箱内培养。
3.6 每 2-3 天更换一次培养基，待细胞融合度达到 80%左右时，进行细胞传代操作或者收获细胞进行细胞冻存操作。
3.7 细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量无血清冻存液(Cat#05-713-1) 中，装入冻存管， -80°C冰箱放置 24h，转入液氮罐中长期冻存。
4. 间充质干细胞复苏
4.1 从冰箱中取出完全培养基，在生物安全柜或超净台中吸取适量（如T-75瓶：10-15mL)完全培养基沿上表面加入间充质干细胞培养瓶中，切勿冲到细胞培养瓶底面，即：细胞生长面。然后慢慢将细胞培养瓶平放，在37℃、恒温CO2培养箱中放置5-10分钟后使用。
注：请严格按照此步骤操作，否则可能会出现细胞培养瓶中细胞生长空白区域，即所谓的“生长空洞”。多数用户使用的不是专用的预包被细胞培养瓶，而是普通的细胞培养瓶或培养皿，其表面环境并不利于无血清培养环境下的间充质干细胞贴壁。37℃放置5-10分钟，可让培养基中的促贴壁物质更好地与细胞培养瓶底部结合，使得间充质干细胞的贴壁能力增强，降低“生长空洞”出现的概率。
4.2 从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴中，快速融解。
注：尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险；要快速完成细胞复苏过程（尽量控制在1分钟内），融化过程时间过长，会造成复苏后细胞活性较差。
4.3 用70%-75%酒精消毒冻存管外壁，在生物安全柜或超净台中打开冻存管，用吸管/移液器将细胞冻存悬液缓慢移入装有5-10mL细胞完全培养基的15mL离心管中（在这一过程请尽可能避免产生气泡）。
注：为了减少细胞损失，往细胞冻存管中加入1mL完全培养基，稍微吹打，用吸管/移液器将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管/移液器将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。
4.4 1200rpm离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，取一部分细胞进行台盼蓝染色计数，按密度8000 cells/cm2将细胞接种至步骤4.1中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。
4.5 轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。
4.6 2-3天后，更换新鲜的完全培养基（温育至37℃）。
八、案例
