EdU 细胞增殖检测试剂盒（细胞成像法）

EdU 细胞增殖检测试剂盒（细胞成像法）

EdU细胞増殖检测试剂盒(红色荧光)使用说明

产品简介
       细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理 和病理状况的重要指标。EdU (5-Ethynyl-2^,- deoxyuridine)是一种胸腺喃陡核苷类似物，其连 有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在 细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制 的DNA分子中，通过基于EdU与荧光染料的 特异性共轭反应，把荧光集团标记到新合成的 含有EdU的DNA上面，这样就可以进行高效 快速的检测出DNA复制活性，广泛应用于细胞 增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复 等方面的研究。
       传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法需 要DNA变性、抗原修复、抗原抗体过夜孵育等 复杂繁琐的操作步骤。而EdU检测方法不需要 剧烈的DNA变性，只需温和的细胞固定化和透 化处理，能够较好地保护细胞形态、DNA整体 结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快 速、灵敏和准确。EdU与胸腺嘧啶(T )结构 非常相似，而EdU染料大小只有BrdU抗体的 1/500,在细胞内很容易扩散，无需DNA变性(酸 解、热解、酶解等)，可有效避免样品损伤，而 且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更 快速便捷地反映DNA复制活性。


试剂盒组分

使用前须知
       该试剂盒是采用成像检测方法对贴壁细胞 进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜 等仪器。非贴壁细胞可在孵育EdU后进行细胞 涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程 进行检测。也可以应用于流式细胞仪检测。

实验步骤(以24孔板，HK2贴壁细胞为例)
       EdU标记
(a)      将细胞完全培养基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液，制成2xEdU标记培养基；
(b)      提前将2xEdU标记培养基预热， 然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得 lxEdU溶液，其中EdU的终浓度为10 uM；
注：    1)我们不建议替换全部培养基，因为 这样可能会影响细胞增殖的速度；
           2)配置好的培养基建议现用现配，用 量以没过细胞为宜；
(c)      每孔加入300ul含EdU培养基孵育细胞2小时，弃培养基；
注：   1)培养时间取决于细胞的增殖速度和 生长状态；
          2)大多数肿瘤细胞以及粘附细胞系均 可采用2小时的孵育时间
(d)     以lxPBS清洗细胞两次，毎次5分钟， 以除去未掺入DNA的EdU残留。
注：  贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

细胞的固定和通透
(a)     每孔加入150ul 4%多聚甲醛细胞固 定液，室温培养30分钟，弃固定液；
(b )    毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸，摇床孵育5分钟，以中和过量的多聚甲醛；
(c )    弃甘氨酸溶液，每孔加入300 ul PBS 洗液，室温清洗5分钟；

(d)     每孔加入300ul 0.5% Triton X-100细 胞通透液，室温通透10分钟，弃细胞通透溶液；
(e )    每孔加入300ul PBS洗液，室温清洗 5分钟；

EdU染色
(a)     通过用10: 1去离子水稀释10x反应缓冲液进行配制1xEdU反应缓冲液；
(b)     按照溶解200mg缓冲添加剂溶于1ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解， 即为可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配；
注：  缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20%，且该粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
(c)     按照以下的表格进行染色反应液的配制：

(d)     每孔加入100ul配置好的检测混合液，以覆盖细胞为宜，避光、室温孵育30分钟。
(e)     弃染色反应液，加入300 ul  0.5% TritonX-100细胞渗透液清洗2-3次，每次10 分钟；
(f)      弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5分钟。

DNA染色

(a )将 Hoechst 33342用 PBS 溶液 1: 1000 进行稀释得到终浓度为5ug/ml的lxHoechst染色液；
(b )每孔加入300ul 1xHoechst染色液，室温避光孵育20-30分钟后，弃染色液；
(c )每孔加入300ul PBS洗细胞两次，去掉洗液。

图像获取及分析
       建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观 察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片， 可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4°C条件下保存及拍照检测。

            案例图示

  图注：将HK2细胞分别用DMSO以及药 物Cisplatin进行处理之后，通过我们公司的 EdU检测试剂盒检测药物处理是否影响细胞的增殖能力。