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快速鼠尾基因型鉴定(PCR法)试剂盒

快速鼠尾基因型鉴定(PCR法)试剂盒

发布日期:2019-09-10 浏览次数:252

快速鼠尾基因型鉴定(PCR法)试剂盒
说明书


产品组分

组分名称

M00301-100T

M00301-500T

M00301-1000T

存储条件

鼠尾裂解液

10 ml

25ml×2

25ml×4

4°C

蛋白酶K

1 ml

1 ml×5

1ml×10

-20°C

2×PCR Easy Mix

1ml

1ml×5

1ml×10

-20°C

 


实验方法
1、组织消化
    1.1按照小鼠数量配制组织消化液,试剂比例如下:

 

单样本

蛋白酶K

10 μl

鼠尾裂解液

100 μl


组织消化液现用现配,充分混匀后使用。
1.2 向每个含有样本的EP管中加入100 μl新鲜组织消化液,55°C水浴/金属浴中消化30分钟。组织消化时,请务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后,组织外观上依然完整,但足量的基因组DNA已经释放,不影响后续的PCR实验。
1.3 将样本置于95°C水浴/金属浴中孵育5分钟以灭活消化液中蛋白酶。12000rpm离心5分钟,取上清作为PCR模板。消化后的上清可于-20°C保存三个月。

2、PCR扩增
2.1 PCR反应体系的配制:
最好于低温环境下(如冰浴中)完成,以保证PCR扩增效率和特异性。

PCR反应组分

20 μl反应体系

50 μl反应体系

模板(消化产物)

2 μl

5 μl

正向引物(10 μM

0.5 μl

1 μl

反向引物(10 μM

0.5 μl

1 μl

2×PCR Easy Mix

10 μl

25 μl

ddH2O

7 μl

18 μl


2.2 PCR反应条件:

温度(°C

时间

循环数

94

5 min

1

94

20 sec

 
35-40

50-65

30 sec

72

X min (1kb/min)

72

5 min

1

4

--

1


3、琼脂糖凝胶电泳
试剂中含有溴酚蓝染料,PCR产物可以直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。另外PCR产物的3’端带有碱基A,可直接克隆至T载体,用于DNA测序。
 
常见问题及对策分析

常见问题

可能原因

对策

样本组与阳性对照组均无扩增条带

PCR反应条件设置不当

优化PCR反应条件

PCR引物质量问题

重新设计PCR引物

样本组无扩增条带而阳性对照组正常

不当储存或长期储存引起试剂活性丧失

使用新鲜的试剂

组织消化不够充分

延长55°C消化时间至60min

蛋白酶未被完全灭活

消化产物在95°C孵育5min

存在非特异性扩增条带

PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高

增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度

PCR引物错配

重新设计PCR引物

配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久

PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后请尽快进行PCR扩增反应

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